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    公开号:WO1992015692A1
    申请号:PCT/JP1992/000267
    申请日:1992-03-06
    公开日:1992-09-17
    发明作者:Hideaki Hagiwara；Yasunobu Takeshima
    申请人:Hagiwara, Yoshihide；
    IPC主号:C12N15-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 新規プラスミ ド
    [0003] 技術分野
    [0004] 本発明は新規プラスミ ドに関し、 さらに詳しくは、 ラン藻アナキステ イス .ニジュランス （Anacystis nidulans) 由来のプラスミ ド p BA l の Or i A領域含有 DN A断片を含む大腸菌及びラン藻細胞内で複製可 能なシャトルベクタープラスミ ドに関する。
    [0005] 背景技術
    [0006] ラン藻 Anacystis nidulans は、 高等植物、 特に紅藻の光合成機構と 類似しており、 太陽からの光をエネルギー源とじて、 水、 二酸化炭素と わずかな無機塩類とから有機物質を生合成し、 独立栄養的に増殖するこ とが可能である。 また、 A. nidulans は単細胞性で寒天培地上にコロニ 一を作り、 特に R2株は細胞中に DNAを取り込みやすく、 微生物遺伝 学的方法により形質転換することが可能である。
    [0007] そこで近年、 A. nidulans R2株の内在性プラスミ ド （たとえば pU H24、 pUH25) を用いたクローニングベクターが多数開発され
    [0008] [C. A. M. J. J. von der Hondel et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(3)： 1570-1574 (1980); C. J. Kuhlemeier et al. , Mol. Gen. Genet. 184:249-254 (1981); L. A. Sherman and P. van de Putte, J.
    [0009] Bacteriol. 150(1) :410-413 (1982); S. Gendel et al. , J. Bacterio
    [0010] 1. 156(1) :148-154 (1983); S. S. Golden and L. A. Sherman, J. Bac teriol. 155(3) :966-972 (1983); C. J. Kuhlemeier et al.， Plasmid 10:156-163 (1983); C. J. Kuhlemeier et al.， Gene 31;109-116 (198 4); D. E. Laudenbach et al. , Mol. Gen. Genet. 199:300-305(1985); M. Y. Gruber et al. , Curr. Microbiol. 15:265-268 (1987) など参 照] 、 外来遺伝子の導入や遺伝子のクローニングなどに用いられてきて いる。
    [0011] R 2株を用いて異種タンパク質を発現させた例としては、 ヒ卜の力一 ボニック ·ァンヒドラ一ゼおよび大腸菌 1 a c I Qリブレッサータンパ ク質 [G. D. Price and Μ. β. Badger, Plant Physiol. 91:505-513
    [0012] (1989) ] 、 Bacillus arayloliquefaciens A50の α—アミラーゼ [I. V. Elanskaya and I. B. Morzunoba, Mol. Genet. Microbiol, yirusol.
    [0013] 0(9):7-ll (1989)] 、 B. sphaericus 1593Mの殺虫タンパク質 [N. Tan deau de Marsac et al.， Mol. Gen. Genet. 209:396-398 (1987)] 、 大 腸菌の yS—ガラク トシダーゼ [D. J. Scanlan et al. , Gene. 90:43 - 49
    [0014] (1990)、 Ji. R. Schaefer and S. S. Golden, J. Bacteriol. 171(7) :397 3-3981 (1989)]、 大腸菌の Mn—スーパーォキシドジスムターゼ [1ί. Υ.
    [0015] Gruber et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2608-2612(1980)]、 ラムダファージの c I tsリプレッサータンパク質 [D. Friedberg and J. Seiiffers, Mol. Gen. Genet. 203:505-510.(1986)]、 ラン藻 Synecho systis PPC 6803株のディサチュレース （des A) [H. fada et al.， a ture 347:200-203 (1990) ] などが知られている。
    [0016] —方、 A. nidulans 6301株でも、 内在性プラスミ ド （pBAl) を用いて pB AS 18 [12kb， K. Shinozaki et al. , Gene. 19:221-22 5 (1982)]. pBAS 5 [14 k b、 篠崎一雄、 「植物遺伝子操作技術」 山ロ彦之監修 P 98— 110、 CMC刊] などのベクター （大腸菌との シャトルベクター） が開発されているが、 いずれのベクターも 1 Okb 以上の長さを持つことからベクターに挿入できる遺伝子の大きさ力、'限定 されたり、 クローニングに用いることのできる制限酵素認識部位が少な いことなど遺伝子操作上扱いにくい点が多い。 また、 6 3 0 1株は R 2 株に比べ遺伝子 D N Aを細胞中に取り込みにく く、 その結果、 形質転換 効率も R 2株に比べ低いという欠点がある。 6 3 0 1株の形質転換効率 を向上させる方法として、 H. Daniell ら [Proc. Natl. Acad. Sci. US
    [0017] 5
    [0018] A 83:2546-2550(1986)] は、 6 3 0 1株の細胞を E D T A— Lysozyrae 処理して permeaplast 化して D N Aを取り込みやすくすることを提案 している。 実際、 この方法を用いて 6 3 0 1株の形質転換効率を高める ことに成功しているが、 その操作は時間のかかる煩雑なものであるとと もに、 E D T A— Lysozyme処理によって細胞にダメージをあたえるな
    [0019] D
    [0020] どの問題がある。
    [0021] そこで、 本発明者らは、 A. nidulans 6 3 0 1株の形質転換効率の向 上、 遺伝子操作上扱いやすいプラスミ ドの構築等を目的に、 まず、 ブラ スミ ドを小型化することについて鋭意研究を行い、 6 3 0 1株の内在性 δ プラスミ ド （p B A l ) をベースにして、 その複製開始領域以外の部分 をなるベく少なくするとともに、 これに大腸菌の C o 1 E l系プラスミ ドの複製開始領域 （0 r i E領域） を含み r o p領域 （この領域は r o m領域とも呼ばれるが、 本明細書では r 0 p領域という） によって規定 される遺伝子を除いた D N A断片と p U C 1 8で用いられているマルチ クローニング領域とを組合せることにより、 6 3 0 1株の形質転換効率0
    [0022] を飛躍的に向上させることのできるブラスミ ドを創製することに成功し、 本発明を完成するに至った。
    [0023] 発明の開示
    [0024] かく して、 本発明によれば、 (a) アナキステイス 'ニジュランス （Anacystis nidulans) 由来の プラスミ ド p B A 1の O r i A領域と、
    [0025] (b) マルチクローニング領域と、
    [0026] (c) コリシン E 1 (C o 1 E 1) 系プラスミ ドの 0 r i E領域を含 み r o p領域によって規定される遺伝子が除かれた領域
    [0027] を含有することを特徵とする大腸菌及びラン藻細胞内で複製可能なシャ トルベクタープラスミ ドが提供される。
    [0028] 以下、 本発明のプラスミ ドについてさらに詳細に説明する。
    [0029] 本発明のプラスミ ドを搆成する 「アナキスティ'ス ·二デュランス （An acystis nidulahs) 由来のプラスミ ド p BAlの O r i A領域」 （以下、 「O r i A」 と略称すること ある） は、 ラン藻クロォコッカス属に属 するアナキスティス ·ニデユランス 6301株 （Synechococcus PPC 63 01、 ATCC 27144..UTEX 625株） の 2つの内在性プラスミ ドのうち分子量 が 5. 04±0. 26 X 106 (電子顕微鏡分析による） 又は 5. 2x 106 (ァガロースゲル電気泳動分析による） [K. Shinozaki et ah, G ene. 19:221-224 (1982)] を示すプラスミ ド p B A 1に由来する複製開 始領域を含む遺伝子断片でありミ その大きさは一般に 2. 8〜 8. · 0 k b、 好ましくは 2. 8〜4. 4k bの範囲内にあることができる。 具体 的には、 p BAlを制限酵素 Xh o I及び B amH Iで切り出すことに より得られる大きさが約 4. 4k bのO r i A領域含有DNA断片、 P vu I I及び B a mH Iで切り出すことにより得られる大きさが約 3. 3 k bの O r i A領域含有 DN A断片等が挙げられる。
    [0030] また、 「マルチクロ一ニング領域」 （以下、 「MC領域」 と略称する ことがある） は、 多種の制限酵素認識部位を持った配列 （ポリリンカ一 と ¾いう） であり、 具体的には、 大腸菌クローニングべクタ一として用 いられる C ο 1 E 1系プラスミ ド pUC、 例えば pUC 18由来の、 E c oR I、 S a c l、 Kpn l、 Sma l、 Xma l、 B amH I、 X b a l、 S a l I、 Ac c l、 H i n c l I、 Ps t l、 Sph l、 H K i n d I I Iの制限酵素認識部位をもつ 55bpの DNA断片が包含され る。 また pUC12、 pUC 13、 pUC 19等に由来する MC領域も 使用可能であり、 大腸菌のファージベクター Ml 3由来の MC領域も使 用することができる。 さらに、 化学的に合成した MC領域も使用するこ とができる。
    [0031] 0 さらに、 本発明において、 0 r i Aと MC領域と組合せて使用きれる 「Co 1 El ·系プラスミ ド由来の Or i E領域を含み r o p領域によつ て規定される遺伝子が除かれた領域」 （以下、 「Or i EJ と略称する ことがある） は、 大腸菌で用いられているコピー数が 1細胞体当り 20 〜30個である Co 1 E 1系プラスミ ドの複製開始領域を意味し、 その ような Or i Eの代表例としては、 プラスミ ド PBR322から制限酵 素 Pvu l I、 Av a l、 BamH I、 E c o 47 I I I、 Ec oRV、 P s t Iなどを用いて切り出すことができる大きさが 1. 5〜4. l k b、 好ましくは 1. 5〜2. 5 k bの 0 r i E含有 DNA断片が挙げら れ、 その他にプラスミ ド pUC 18等に由来する 0 r i E含有 DNA断- 片も使用することができる。
    [0032] また、 これらの Or i E含有 DNA断片はクローニングを行なう際の マーカーとなりうるアンピシリン耐性遺伝子 （Amp 等の薬剤耐性 遺伝子を含むことができる。
    [0033] 本発明により提供されるプラスミ ドは、 以上に述べた 0 r i A、 MC 領域及び O r i Eの 3つの必須の遺伝子領域をそれぞれ含有する DNA 断片を有する限り、 他の遺伝情報を担う DNA断片、 例えば抗生物質耐 性マーカ一であるアンピシリン耐性遺伝子を含む DN A断片、 クロラム フエニコール耐性遺伝子を含む D N A断片等をさらに含みうるが、 典型 的な具体例は、 O r i A、 MC領域及び O r i Eの 3つの遺伝子領域を それぞれ含有する D N A断片から実質的になり、 分子量がそれぞれ約 4. 48メガダルトン （約 6. 9 k b) 、 約 4. 15メガダルトン （約 6. 4 kb) および約 3. 76メガダルトン （約 5. 8 kb) であるプラス ミ ドで、 本発明者らが「プラスミ ド pBAXi 8」及び「プラスミ ド p BAX20J とそれぞれ命名した 2種のプラスミ ドである。
    [0034] なお、 本明細書において、 プラスミ ドの分子量はァガロースゲル電気 泳動法により測定した値である。 '
    [0035] 以下、 このプラスミ ド pBAXl 8及び P BAX20について.さらに 詳細に説明する。
    [0036] 図面の簡単な説明
    [0037] 第 1図はプラスミ ド p BAXl 8の制限酵素地図であり、 第 2図はプ ラスミ ド p BAX20の制限酵素地図であり、 第 3図はブラスミ ド AX18及び p BAX20の構築図である。
    [0038] プラスミ ド p BAXl 8及び p B AX 20の種々の制限酵素による認 識部位の数及び該制限酵素による分解断片の長さ （kb) は下記の表
    [0039] - 一
    [0040] 1に示すとおりである。 また、.プラスミ ド pBAXl 8及び P BAX2 0の制限酵素地図を第 1図及び第 2図に す。 プラスミ ド pBAX18 プラスミ ド ρΒΑΧ20 制限酵素 認識部位 分解断片の 認識部位 分解断片の
    [0041] の数 長さ (kb) の数 長さ (kb)
    [0042] EcoEI 1 6.9 1 5.8
    [0043] BamHI 1 6.9 1 5.8
    [0044] Xbal 1 6.9 1 5.8
    [0045] Smal 1 6.9 1 5.8
    [0046] Bglll 1 6.9 5.8
    [0047] n nnaTx υ. ο 0. 0
    [0048] o
    [0049] EcoRV 6.9 0.8
    [0050] 1 1
    [0051] Seal 1 6.9 1 5.8
    [0052] PvuII 2 6.4、 0.45 1 5.8
    [0053] Hindlll 3 .5.1、 1.5、 3 4.0、 1.5、
    [0054] 0.3 0.3
    [0055] Kpnl 4 2,8、 1.7、 3 3.3、 1.7、
    [0056] 1.5、 0.84 0.84
    [0057] Pstl 5 3.8、 1.45、 5 2.7、 1.45、
    [0058] 0.85、 0.55、 0.88.0.55、
    [0059] 0.25 0.25
    [0060] 以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミ ド p B AX 18及び p BAX20は、 例えば次のようにして製造することができる。 まず、 アナキスティス '二デュランス由来のプラスミ ド p BA lの 0 r i A含有 DNA断片の調製は、 例えば、 アナキスティス ·ニデユラン スと大腸菌とのシャトルベクタ P B A S 18 [K. Shinozaki et al. , Gene 19:221-224 (1982)参照] を大腸菌で常法 (T. Maniatis et al.， Molecular cloning 一 a Laboratory Manual— Cold Spring Hobor Lab oratory刊） に従ってクロ一ニングし、 そのクローニングされたプラス ミ ド pBAS 18を常法 （T. Maniatis et al.， Molecular cloning) に従って、 制限酵素 BamH I及び Xho Iの組合わせ又は制限酵素 B amH I及び P v u I Iの組合わせを用いて D N A断片を切り出すこと によって行なうことができ、 これにより、 大きさがそれぞれ約 4. I k
    [0061] 5
    [0062] b及び約 3. 3 k bの 0 r i A含有 DNA断片が得られる。 これらの D N A断片の 5' 突出端は場合により T4DNAポリメラーゼによって平 滑末端化することができる。
    [0063] —方、 プラスミ ド pUCの MC領域は、 例えばプラスミ ド pUC 18 を制限酵素 Ec oR I及び H i n d I I Iを用いて切り出すことにより
    [0064] ID
    [0065] 調製することができる。 - さらに、 Co I Elプラスミ ドの Or i E領域を含み r o p領域によつ て規定される遺伝子が除かれた領域を含む DNA断片の供耠源と'しては、 Co 1 E1プラスミ ドとして代表的なプラスミ ド PBR322を使用す るのが便利である。
    [0066] 5
    [0067] 上記の如くして調製された MC領域を制限酵素 E c oR I及び H i n d I I Iで処理したプラスミ ド pBR322と一緒にし、 T4DNAリ ガーゼを作用させて、 プラスミ ド p BR322に上記 MC領域が み込 まれたプラスミ ド PBR322Mを作成する。 次いで、 このプラスミ ド pBR322Mを制限酵素 E c o 47 I I I及び Pvu I I処理して得0
    [0068] られる Or i E及び MC領域を含む約 2. 5kbの DNA断片と、 上記 のようにして調製された 0 r i A含有 DNA断片とを一緒にし、 T4D NAリガーゼを作用させることにより、 目的とするプラスミ ド pBAX 18及び pB AX 20を得ることができる。 なお、 プラスミ ド pBAXl 8および P B AX 20の構築図を第 3図 に示し、 そのさらに具体的な調製法については後記実施例でさらに詳細 に説明する。
    [0069] このようにして調製される本発明プラスミ ドは、 大腸菌の細胞中で自 律複製可能な 0 r i E領域と、 アナキスティス ·二デュランスの細胞中 で自律複製可能な Or i A領域を有するシャトルベクターである。 従つ て、 本発明のプラスミ ドは、 増殖の速い大腸菌を用いて大量に調製する ことができ、 このようにして大量に調製されるプラスミ ド DNAを用い ればアナキスティス ·二デュランスなどのラン藻細胞を効率よ'く形質転 換することができる。
    [0070] また、 本発明のプラスミ ドは、 マルチクローニング領域が導入されて いることにより、 （外来） 遺伝子を挿入するための認識部位としてブラ スミ ド pBAS 18で唯一用いられる E c oR I認識部位以外に Sma I、 BamH I、 Xb a l、 S c a l、 EcoRVなどの認識部位が利 用可能である。
    [0071] さらに、 本発明のプラスミ ドの大きさは、 プラスミ ド pBAlの Or i A領域以外の DNA部分が除かれていることにより、 プラスミ ド pB AS 18 (12kb) の約半分 （6. 9kb〜5. 8 k b) にまで小型 化することができ、 これにより、 本発明のプラスミ ドはプラスミ ド pB AS 18に導入できる （外来） 遺伝子よりも大きな （外来） 遺伝子を導 入することが可能となる。
    [0072] 以上のような遺伝子操作上の特性を有する本発明のブラスミ ドの宿主 細胞への導入は、 それ自体既知の方法、 例えば、 D. A. Lightfoot et. al., J. General Microbiol. 134:1509-1514 (1988)等の文献に記載の 方法で行うことができる。
    [0073] このようにして形質転換されたアナキスティス ·二デュランス 630 1株の形質転換効率は、 プラスミ ド pB AS 18を用いて形質転換した ときの値に比べ約 1000倍の効率を得ることができる。 従って、 本発 明のプラスミ ドを用いれば、 （外来） 遺伝子を揷入した場合においても、 目的の遺伝子が挿入されたプラスミ ドを有する細胞を容易に選抜するこ とが可能である。
    [0074] 本発明のプラスミ ドに組み込み可能な構造遺伝子としては、 アナキス ティス ·ニデユランス由来の構造遺伝子、 他のラン藻細胞由来の構造遺 伝子、 他のバクテリア由来の構造遺伝子、 高等動植物細胞由来の構造遺 伝子などが挙げられ、 その起源は何ら限定されるものではない。 また、 本発明のプラスミ ドに組み込み可能な構造遺伝子としては、 化学的に合 成された構造遺伝子であってもよい。 そのような遺伝子の例としては化 学合成ヒトースーパーォキシド ' ジスムターゼ [h^SOD、 h-SO D-A 1 a6 (特開平 2— 156884号公報参照） など] が挙げられ る。
    [0075] 実施例
    [0076] 以下、 実施例をあげて本発明のプラスミ ドについてさらに具体的に説 明する。
    [0077] 実施例 1
    [0078] (ベクタ一の造成)'
    [0079] (1) p BR322へのマルチクロー ングサイト （pUC18由来） の導入
    [0080] A) pBR322のEc όRΊ—H i nd ϊ I I消化、 アル力リフォス ファターゼ処理
    [0081] p BR322DNA溶液 20〃1 (10〃g) に 5X H i n d i I I buffer (5 OmMT r i s -HC 1 (pH7. 5) 、 35 mMM g C 12、 3 0 OmMNa C 1 ) 40 1、 H i n d I I I [宝酒造 （株） 社製] 80u nits (1 0 βϊ 及び滅菌水 130〃1を加え、 37°Cで 2時間ィンキュ ベートした。 反応後、 この溶液に 5 X E c o R I buffer (50 ΟιΜΤ r i s -HC 1 (pH7. 5) 35mMM C 12 25 OmMNa C 1 , 35BM2—メルカプトエタノール、 0. 05%ゥシ血清アルブミン） 4 0 ΐ, E c oR I [宝酒造 （株） 社製] 120 units (10 ^1) 及び 滅菌水 50 ^1を加え、 さらに 37でで 2時間反応させた。 反応後、 フ エノールークロロホルム処理、 エタノール沈殿して DNAを集め、 10 0〃1の0. 1ΪΤ r i s— HC 1 (pH8. 0) に溶解した。 この溶液に 10 / 1のアルカリフォスファターゼ [宝酒造 （株） 社製] 溶液 （luni tZl 0〃1アルカリフォスファターゼ、 1 OmMT r i s— HC 1 (ρΗ7. 5) 、 5 OmMNa C 1、 lmMZn S04) を加え、 37 で 1時間イン キュペートした。 反応後、 1.0 //1のアルカリフォスファターゼ溶液を 加え、 さらに 65 で 30分間インキュベートした。 この溶液をフエノ 一ルークロロホルム処理し、 エタノール沈殿して DN Aを Θ収した。 B) pUC 18からのマルチクローニングサイ ト （E c oR I— H i n d I I I ) の単離
    [0082] pUC 18 DNA溶液 30 βΐ (20 zg) に 10 X K buffer (20 OmMT r i s -HC 1 (pH8. 5) 、 100 mMM g C 1 2、 1 OoMMD T T、 100 mMMK C I ) 20 /^1、 H i n d i I 1 80 units (10〃 1) 及び滅菌水 140〃1を加えたエツペンドルフチューブ 2本用意し、 37でで 3時間インキュベートした。 反応後、 フエノールークロロホル ム処理し、 エタノール沈殿して DNA集め、 112. 5〃1の滅菌水に 溶解した。 これらの溶液に 5 X Ec oRI buffer 30〃1、 EcoR
    [0083] I 9 Ounits (7. 5 Ό を加え、 37 で 3時間インキュベートした。 DNAをエタノール沈殿して回収し、 1. 5%ァガロースゲル電気泳動
    [0084] 5
    [0085] を行い目的の DNA断片 （約 50 bp) を分離した。 DNAをゲルから 電気的に溶出し、 フエノールークロロホルム処理、 エタノール沈殿して 精製した。
    [0086] C) p BR322 (EcoR I— Hi nd i I I消化） とマルチクロー ニングの連結
    [0087] 10
    [0088] p BR322 (EcoRI—Hi nd i I I、 AP処理） DNAO. 2 £g とマルチクロ ニングサイト DNA0. 2 jfig (1 に TE (1 OBMT r i s— HC 1 (pH8. 0 ) 、 1 mME D T A) .1 jttl、 Takara ligation Kit A液 24〃 1を加え、 よく撹拌した。 この溶液に Takara ligation Kit B液 3 1を加え 16 で 4時間インキュベート 丄 5
    [0089] した。
    [0090] D) プラスミ ド PBR322Mのクローニング ligation溶液 3〃1 ( 40 ng) に 5 OmMC a C 12処理した E. c o 1 i HB 101の細胞懸濁液 200 ilを加え、 おだやかに混合した。 この混合液を氷水中で 30分間ィンキュベートした後、 さらに 42でで 0
    [0091] 2分間ィンキュベートして DNAを細胞中にとりこませた。 この懸濁液 に 1. 8mlの 2ΥΤ (16gZlトリプトン、 10 g/1酵母抽出液、 5 gZlNaC I) 液体培地を加え、 37^で 1時間の振とう培養後、 L B (l OgZlトリプトン、 8g71NaC l、 5 gZl酵母抽出エキス） 寒天培地 （5 ノ mlアンピシリンを含む） にプレートした。 得られ たコロニーからプラスミ ドを調製し、 制限酵素地図を解析することによ り目的のプラスミ ド （pBR322M) を保持しているコロニーをスク リーニングした。 スクリーニングしたコロニーを 200011の2丫丁液体 培地 （100 igZmlアンピシリンを含む） で培養し、 プラスミ ド DN
    [0092] Aを SDS—アル力リ法により大量に調製した。
    [0093] (2) Pvu l I -E c o 47 I I I断片 （2550bp) の単離 前記 （1) で調製した p BR322Mプラスミ ド DNAl O^g (1 0 nl) に 10 X M buffer (100mMTr i s-HC l (PH7. 5 ) 、 10 OmMMg C 12. 10mMDTT、 50 OmMN a C 1 ) 20//1、 P v u I I [宝酒造 （株） 社製] 12 Ounits (10 1) および滅菌水を加 え 200〃1としたエツペンドルフチューブ 3本用意した。 これらのチ ユーブを 37でで 3時間インキュベートした。 反応後、 フエノールーク ロロホルム処理し、 DN Aをエタノール沈殿して集め、 174 1の滅 菌水にそれぞれ溶解した。 これらの溶液に 10X H buffer 20 1お よび E c o 47 I I I [宝酒造 （株） 社製] 24 unitsずつ加え、 37 でで 3時間ィンキュベートした。 DNAをエタノール沈殿して回収し、 目的の DNA断片 （2550 b p) を 1. 5 %ァガロースゲル電気泳動 により分離した。 分離した DNA断片は Geneclean を用いて精製し、 の 0. lMT r i s—HC l (pH8. 0 ) 溶液とした。'この溶液 に 5 lの了ルカリフォスファターゼ溶液を加え、 37°Cで 1時間ィン キュペートした。 反応後、 5〃1のアルカリフォスファターゼ溶液を加 え、 65 で 30分間さらにインキュベートした。 反応後、 フエノール —クロ口ホルム処理し、 エタノール沈殿して DNAを集め、 20〃1の TEに溶解した。
    [0094] (3) p BAS 18の A. nidulans における複製開始点の分離
    [0095] P BR322の B amH Iサイトに nidulans 6301株の内在 性プラスミ ド （p BA l、 B amH I消化） を揷入した大腸菌と A. ni dulans との間のシャトルベクター p B A S 18 (K. Shinozaki ら、 Ge ne. 19:221-224 (1982)) を E. c o 1 i HB 101に導入し、 LB液 体培地 （50 igZmlアンピシリンを含む） で培養し、 SDS—アル力 リ法を用いて大量に調製した。 調製した p BAS 18DNA 14 £g (2 O jtzl) に 10X K buffer 20 ΐ, B amH I [宝酒造 （株） 社製] 100 units (10 / l) および滅菌水を加えて 200 /1としたエツべ ンドルフチューブ 3本用意し、 30でで 3時間インキュベートした。 反 応後、 DNAをエタノール沈殿して回収し、 目的の DNA断片 （p BA 1、 約 8. 0Kb p) を 1%ァガロースゲル電気泳動を行い分離し、 Ge neclean により精製した。 分離 ·精製した p BAl (B amH I消化） に 10X K buffer 5 fil、 Xh o I [宝酒造
    [0096] (株） 社製] 2.4units (2〃1) および滅菌水 38〃1を加え、 37 で 3時間インキュベートした。 反応後、 フエノールークロロホルム処理 し、 エタノール沈殿して DN Aを集めこ。 得られた p B A 1の B amH I -Xh o I消化 DNAの両末端を Takara Blanting Kit を用いて平滑 末端化した。
    [0097] (4 )一小一型（匕 E. c o 1 i -A. nidulans シャトルベクター p B AX 1 8 (6. 9 k b p) の造成
    [0098] 平滑末端化 DNA 4 Ong (2 β1) と P v u I I -E c o 47 I I I 靳片の DNA200ng (4 ^1) に Takara ligation Kit A液 48〃1 を加え、 よく撹拌した後、 B液 6 ^1を加え、 16 で 4時間インキュ ベートした。 この溶液を用い E. c o 1 i HB 101株を形質転換し、 LB寒天培地 （50〃gZmlアンピシリン、 1. 5%寒天を含む） にプ レートしてコロニーを得た。 得られたコロニーからプラスミ ドを調製し、 制限酵素地図を解析することにより目的のプラスミ ド p BAX l 8を保 持するコロニーをスクリーニングした。 スクリーニングしたコロニーを 45mlの 2 YT液体培地 （100 ^gZmlのアンピシリンを含む） で培 養し、 プラスミ ド DNAを SDS—アルカリ法により調製した。
    [0099] (5) p B AX20 (約 5. 8 k b ) の作成
    [0100] (3) で調製した B amH I— Xh o I (平滑末端化） DNA断片 1 fig (4〃1) に 10X M buffer 2〃l、 P v u I I 1 βΐ {12 unit s) 及び滅菌水 13 1を加え、 37 °Cで 3時間インキュベートした。 こ の反応液 2 1(10 Ong)に （2) で調製した P V u I I - E c o 47 DNA断片10 Ong (2 1) 及び Takara ligation Kit A液 16〃1 を加え、 よく撹^した後、 さらに、 B液 を加え、 16でで 2時間 ィンキュベートした。 反応後、 この溶液を用いて. E. c 0 1 i HB 1 01株を形質転換し、 LB寒天培地 （50 ^gZmlアンピシリン、 1. 5%寒天を含む） にプレートしてコロニーを得た。 得られたコロニーか ら目的のプラス'ミ ド （p BAX20) を保持しているコロニーをスクリ 一二ングし、 200mlの 2 YT液体培地 （100 zgZmlアンピシリン を含む） で培養し、 プラスミ ド DNAを SDS—アルカリ法により調製 した。
    [0101] 実施例 2
    [0102] A. nidulans 6301の形質転換 10 Offllの BG— 11液体培地で 1〜5日間培養した細胞を 8000 rpmで 5分間遠心して集め、 1 Oralの新鮮な液体培地に懸濁した （108 〜109 cells/ml) 。 この細胞懸濁液を 1 mlずつポリプロピレンチュ ーブ （Falcon 2059) に分注し、 それぞれのチューブに実施例 1で 調製したプラスミ ド DNAを l g (p BAS 18は 10〃g) の濃度で 加えた。 これらのチューブをそれぞれアルミホイルでおおい、 30でで 1晚培養した後、 おおっていたアルミホイルをはずし、 光照射下 （10 00〜2000ルクス） 、 30°Cでさらに 6時間培養した。 これらの細 胞懸濁液を 5倍に希釈し （p B AS 18を加えたものはそのまま） 、 1 00〜500〃1ずつ BG— 11寒天培地 （1 / gZnilアンピシリン、 1 mMチォ硫酸ナトリウム、 1. 5%寒天を含む） にプレートした。 これら のプレートを光照射下 （2000〜3000ルクス） で 4〜10日間培 し 。
    [0103] このようにして得られたコロニーの形質転換効率は、 本発明プラスミ ドを用いた場合 10-3〜10 -4 cellsZ gブラスミ ド DN Aという値 を示し、 プラスミ ド pBAS 18を用いた場合 （10—7 cells 〃gプ ラスミ ド DNA) の約 1000倍の効率を得ることに成功した。
    [0104] 産業上の利用可能性
    [0105] 本発明のプラスミ ドは、 大腸菌を用いて大量に調製することができ、 大腸菌及びラン藻細胞内で複製可能であって、 シャトルベクターとして、 各種の構造遺伝子のラン藻細胞での発現に有用である。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1. (a) アナキスティス ·ニジュランス （Anacystis nidulans) 由来 のプラスミ ド pBAlの Or i A領域と、
    (b) マルチクローニング領域と、
    (c) コリシン E 1系プラスミ ドの O r i E領域を含み r o p領域 によって規定される遺伝子が除かれた領域
    を含有することを特徴とする大腸菌及びラン藻細胞内で複製可能なシャ トルベクタープラスミ ド。
    2. 0 r i A領域 （a) がプラスミ ド p B A 1から切り出される大きさ が 2. 8〜8. 0 k bの O r i A領域含有 DNA断片である請求の範囲 第 1項記載のプラスミ ド。
    3. 0 r i E領域 （c) がプラスミ ド p BR322から切り出される大 きさが 1. 5〜4. 1 k bの 0 r i E領域を含み r o p領域によって規 定される遣伝子が除かれた DN A断片である請求の範囲第 1項記載のプ ラスミ ド。
    4. 0 r i Eを含み r o p領域によって規定される遺伝子が除かれた D NA断片がさらにアンピシリン耐性遺伝子（Amp を含有する請求の 範囲第 3項記載のプ スミ ド。
    5. 大きさが約 6. 9 k bであり且つ第 1図に示す制限酵素地図によつ て特徴づけられるベクタープラスミ ド PBAX18。
    6. 大きさが約 5. 8 k bであり且つ第 2図に示す制限酵素地図によつ て特徴づけられるベクタープラスミ ド pBAX20。
    7. 構造遺伝子をさらに含有する請求の範囲第 1項記載のプラスミ ドで 形質転換されたラン藻細胞。 IS
    /15692 PCT/JP92/00267
    8. ラン藻細胞がアナキスティス ·ニデユランス 6 3 0 1株である請求 の範囲第 8項記載のラン藻細胞。
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    FI107736B1||
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    EP0576674B1|1999-06-09|
    FI925004A0|1992-11-05|
    DK0576674T3|1999-11-15|
    DE69229392D1|1999-07-15|
    AU1361192A|1992-10-06|
    JPH04281793A|1992-10-07|
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    TW213951B|1993-10-01|
    EP0576674A1|1994-01-05|
    FI925004A|1992-11-05|
    EP0576674A4|1994-04-27|
    RU2122027C1|1998-11-20|
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